U mlađim danima bavio se manekenstvom, zbog čega su ga vršnjaci ismijavali, a kad je od svoje prve zarade kupio automobil, on je bio taj koji se posljednji smijao. A prije nego što se preselio u Los Angeles, gdje je i počeo svoju glumačku karijeru, Jensen Ackles planirao je upisati studij medicine na Texas Teach Universityju.

Budući da su Jensenovi roditelji imali na umu da je ime poput Justin prečesto, svom sinu nadjenuli su upravo ovo ime zato što je rijetko i neuobičajeno. Trebalo im je tri dana da ga izaberu, a listajući himnal u svojoj crkvi naišli su na prezime Jensen i iskoristili ga kao ime za svog sina. Jensen Ackles rekao je da bi se, kad bi bio zvijezda filmova za odrasle, nazvao Pudgy Midway.

S osamnaest godina, 1996., kad su njegovi manekenski dani već bili daleko iza njega, odlučio je usredotočiti se na glumu. Pojavio se u epizodnim ulogama u nekoliko TV serija, a potom se 1997. pridružio glumačkoj postavi dugovječne NBC-jeve sapunice “Naši najbolji dani”, u kojoj se, kao peti po redu glumac koji je utjelovio lik Erica Bradyja, zadržao sve do 2000. (uz epizodno pojavljivanje 2002. godine).

Za svoju ulogu mladog člana brojne obitelji Brady, Jensen je 1998. osvojio nagradu Soap Opera Digest za najbolju mladu mušku pridošlicu u sapunici. Triput je nominiran za nagradu Daytime Emmy, i to u kategoriji najboljeg mladoga glumca u dramskoj seriji ili sapunici.

Nakon odlaska iz izmišljenog gradića Salema iz sapunice “Naši najbolji dani”, Jensenu su ponude počele pljuštati sa svih strana. Godine 2001. dobio je ulogu u televizijskom filmu “Blonde” te u posljednjih dvadesetak epizoda serije “Dark Angel” (2001. - 2002.). Odmah je uslijedila i uloga u posljednjoj sezoni teen-serije “Dawson's Creek” (2002. - 2003.), potom u nikad emitiranoj FOX-ovoj seriji “Still Life” (2003. - 2004.) te u četvrtoj sezoni avanturističke serije “Smallville” (2004. - 2005.).

Jensen je bio prvi izbor producenata za ulogu ljubavnog partnera Elize Dushku, odnosno njezina lika Tru Davies, u drugoj sezoni FOX-ove serije “Pravi poziv”. Međutim, morao se vratiti u Vancouver, gdje je snimao seriju “Dark Angel”, a potom i “Smallville”. Zanimljivo je i to da je njegovu liku u filmu “Devour” oca utjelovio njegov otac u stvarnom životu Alan Ackles. Na snimanju filma “Ten Inch Hero” upoznao je svoju sadašnju suprugu, godinu dana mlađu zvijezdu “Tree Hilla” Daneel Harris.

Popularna horor-serija s elementima paranormalnog, “Lovci na natprirodno”, u kojoj je utjelovio lik Deana Winchestera, ujedno je i najpoznatija u Jensenovoj karijeri. Snima je još od davne 2005. godine, a trenutačno je u 13. sezoni i snimljeno je više od 270 epizoda.

Za ulogu u “Lovcima” Jensen je osvojio nekoliko People's i Teen Choice nagrada. U međuvremenu je snimio još četiri filma - horor “Devour” (2005.), nezavisnu romantičnu komediju “Ten Inch Hero” (2007.), krim-horor “My Bloody Valentine” (2009.) i animirani film “Batman: Under The Red Hood”, u kojem je liku Red Hooda posudio svoj glas. A onda su ponude prestale prštati... Moglo bi se reći da ovaj glumac ima pomalo neobičan izbor kad je karijera u pitanju, jer je posljednjih 13 godina posvećen isključivo “Lovcima na natprirodno”. A uzevši u obzir zadovoljavajuće rejtinge i brojne fanove, ta će serija vjerojatno dobiti i svoju 14. sezonu.

Jensen Ackles jednom je prilikom priznao kako je lud za gumenim i žele bombonima. “Mogao bih ih pojesti na tone, samo što bi mi tada od njih trbuh postao poput želea, a to nije dobro”, izjavio je te dodao kako ne može vjerovati da je to rekao naglas.